Рентгеноструктурний аналіз

Відео: 03.Методи рентгеноструктурного аналізу

Технологічний процес для визначення структури молекули методом рентгеноструктурного аналізу. Спочатку кристал виходить або вирощується в лабораторії, після чого він опромінюється для отримання дифракційної картини у вигляді роздільних плям. Кристал поступово обертається дифракційні картини збираються для кожної чіткої орієнтації кристала. Використовуючи перетворення Фур`є, ці двовимірні зображення перетворюються в тривимірну модель електронної щільності в межах кристала. Розташування атомних ядер виводяться з цієї електронної щільності і хімічних даних, утворюючи модель атомів в межах елементарної комірки кристала. Рентгеноструктyрній анaліз - метод дослідження структури речовини, в основі якого лежить явище дифракції рентгенівського випромінювання на тривимірних кристалічних решітках.
Для дослідження атомної структури застосовують випромінювання з довжиною хвилі порядку 1 A, тобто порядку розмірів атомів. Разом з нейтронографії і електронографії метод відноситься до дифракційних методів дослідження структури речовини.
Метод дозволяє визначати атомну структуру речовини, що включає просторову групу елементарної комірки, її розміри і форму, а також визначити групу симетрії кристала. За допомогою методу можна досліджувати метали і їх сплави, мінерали, неорганічні і органічні сполуки полімери, аморфні матеріали, рідини і гази, молекули білків, нуклеїнових кислот і інші речовини. Легким і успішним є застосування методу для встановлення атомної структури кристалічних тіл, які вже мають строгу періодичність будови і фактично є створеними природою дифракційної гратами для рентгенівських променів. Для інших речовин кристал повинен бути створеним, що є важливою і складною частиною методу рентгеноструктурного аналізу.
Факт явища дифракції рентгенівських променів на кристалах відкритий Лауе, теоретичне обгрунтування явища дали Вульф і Брегг (умова Вульфа-Брегга). Як метод рентгеноструктурний аналіз розроблений Дебая і Шеррер. Рентгеноструктурний аналіз і по сей день залишається одним з поширених методів визначення структури речовини через його простоту і відносну дешевизну.
Дифракція рентгенівських променів на кристалах була відкрита в 1912 році німецькими фізиками Максом фон Лауе, Вільямом Фрідріха і Паулем Кніппінг. Направивши вузький пучок рентгенівських променів на нерухомий кристал, вони зареєстрували на вміщеній за кристалом фотопластинці дифракційну картину, яка складалася з великого числа регулярно розташованих плям. Кожна пляма - слід дифракційного променя, розсіяного кристалом. Рентгенограма, отримана таким методом, що пізніше отримала назву лауеграми.
Розроблена Лауе теорія дифракції рентгенівських променів на кристалах дозволила зв`язати довжину хвилі випромінювання з параметрами елементарної комірки кристала. Фактично було показано, що дифракційна картина кристала являє собою перетворення Фур`є його двомірної проекції. У 1913 році Лоренс Брегг і одночасно з ним Г. В. Вульф запропонували наочніше трактування виникнення дифракційних променів в кристалі. Вони показали, що дифракційні промені можна розглядати як відображення падаючого променя від однієї з систем кристалографічних площин (дифракційне відображення або умова Брегга - Вульфа).
У тому ж році Лоренс Брегг разом зі своїм братом Генрі Брегг вперше досліджували атомні структури простих кристалів за допомогою рентгенівських дифракційних методів. У 1916 році американський фізик Дебай і німецький Пауль Шеррер запропонували використання дифракції рентгенівських променів для дослідження структури полікристалічних матеріалів. У 1938 французький кристаллограф Андре Гинье розробив метод рентгенівського малокутового розсіювання для дослідження форми і розмірів неоднорідностей в речовині.
Можливість використання рентгеноструктурного аналізу для дослідження широкого класу речовин і велика цінність цих досліджень стимулювали розвиток методів розшифровки структур. У 1934 році американський фізик Артур Патерсон запропонував досліджувати будову речовин за допомогою функції міжатомних векторів (функції Патерсона). Американські вчені Девід Харкер, Джон Каспер (1948), Вільям Захаріаса, Девід Сейр і англійський учений Вільям Кокрен (1952) заклали основи так званих прямих методів визначення кристалічних структур. Роботи по дослідженню просторової структури білків, розпочаті в 30-х роках у Великобританії Джоном Берналом і успішно продовжені Джоном Кендрю, Перуцем і іншими зіграли важливу роль в становленні молекулярної біології. У 1953 році дані рентгенострустурного аналізу, отримані Морісом Вілкінсом і Розалінд Франклін дозволили Джеймсу Уотсону, Френсісу Крику створити модель молекули дезоксирибонуклеїнової кислоти. З 50-х років почали бурхливо розвиватися методи обробки дифракційної інформації та аналізу цих даних за допомогою комп`ютерів.
кристалізація
Кристал білка під мікроскопом. Кристали для рентгеноструктурного аналізу мають розміри від 0,1 до 1 мм.



Хоча рентгеноструктурний аналіз може використовуватися для характеризування розташування атомів в забрудненому або невпорядкованій кристалі, в цілому для точного визначення структури метод вимагає кристала дуже високого рівня впорядкованості. Чисті впорядковані кристали іноді формуються мимовільно в природних або штучних матеріалах, наприклад металах, мінералах і інших макроскопічних речовинах. Регулярність таких кристалів іноді може бути вдосконалена за допомогою відпалу і інших методів. Однак, у багатьох випадках, отримання якісного придатного для дифракції кристала є головним бар`єром для визначення його структури на атомному рівні.
Зазвичай рентгеноструктурний аналіз ділиться на аналіз малих молекул і макромолекул, перш за все через різні методи, використовувані для отримання якісних кристалів. Малі молекули цілому мають трохи ступенів конформаційної свободи і можуть бути кристалізовані за допомогою широкого набору методів, наприклад вакуумного нанесення і рекристалізації. На відміну від них, макромолекули в цілому мають багато ступенів свободи і їх кристалізація повинна здійснюватися за умовами точного збереження структури. Наприклад, молекули білків і РНК не можуть бути кристалізувати, якщо їх третинна структура розгорнута, тому методи кристалізації обмежені умовами збереження нативного стану таких макромолекул.
Кристали білків і інших макромолекул майже завжди вирощуються в розчині. Самий загальний підхід - поступове зниження розчинності його компонентів, якщо ж це робиться швидко, молекули преципітує з розчину, формуючи аморфний осад на дні посудини. Зростання кристалів в розчині характеризується двома стадіями: нуклеація, тобто освіту мікроскопічного ядра кристала (що має лише близько 100 молекул), і зростання цього ядра до розмірів, необхідних для аналізу. Умови розчину, кращі для першої стадії (нуклеации), - не завжди найкращі і для другої (зростання кристала). Таким чином, мета кристалографії - створити умови, кращі для росту одного великого кристала, так як великий розмір дозволяє поліпшити якість методу. Зазвичай умови підбираються наспріятлівіми для нуклеації, але сприятливими для росту кристалу, таким чином перший кристал поглине більшість мателіалу з розчини, не залишаючи можливості виникнення численних мікрокристалів. У деяких випадках кристаллограф вдається підібрати умови освіти лише дуже малих кристалів. В такому випадку один з таких кристалів переносілься в іншу посудину, де він може продовжити зростання. У деяких випадках, великі кристали можуть розбиваються для отримання невеликих фрагментів, знову вирощуються для отримання кристалів вішоі якості.


Надзвичайно важко передбачити умови, оптимальні для зростання ідеально впорядкованих кристалів. На практиці, сприятливі умови часто встановлюються за допомогою скринінгу - приготування великої кількості досліджуваної речовини і випробування широкої різноманітності умов кристалізації, часто сотні або навіть тисячі. Для кристалізації різних молекул використовуються різні фізичні механізми зниження розчинності, наприклад зміна pH, додавання солей гофмейстерівськоі серії або знижують діелектричну проникність розчину або великих полімерів, такох як поліетилен гліколь, що виводять молекулу поза фазу розчину через ентропійний ефект. Часто випробовуються різні температури для підбору швидкості кристалізації або для створення перенасиченого розчину. Ці методи вимагають великої кількості досліджуваної речовини восокого ступеня очищення, які, наприклад, в разі білків, часто буває важко отримати. Для економії речовини були розроблені роботи, здатні розподіляти кількості речовини близько 100 нанолітрів, що дозволяє зменшити витрати речовини.
Відомо кілька чинників, що перешкоджають кристалізації. Наприклад, кристали цілому тримають при постійній температурі і захищають від вібрацій, які перешкоджали б отриманню якісного кристала. Домішки в розчині часто ворожі до кристалізації. Конформаційна гнучкість в молекулі також прагне зменшити ймовірність утворення упорядкованого кристала. Цікаво, що речовини, здатні до самосборке в регулярні структури, часто схильні збиратися в кристали. Кристали можуть псуватися сполученням декількох центрів кристалізації, хоча сучасні обчислювальні методи здатні отримувати структуру деяких з таких кристалів. Часто якщо кристалізація не вдається для якоїсь речовини, кристаллограф пробує дещо модифіковану молекулу, навіть дрібниці в молекулярних властивостях можуть призводити значної різниці у властивостях її кристалізації.
Збір даних
закріплення зразка
джерела випромінювання
дефрактометр



Для опромінення кристала потрібно монохроматический джерело рентгенівського випромінювання. Яскраві і корисні джерела рентгенівського випромінювання - синхротрони, велика яскравість їх світла дозволяє отримання найкращої дозволу. Вони також зручні для регулювання довжини хвилі випромінювання, що корисно, напрікад, для фазового аналізу за допомогою методу многоволновой аномальної дисперсії (MAD), описаного нижче. Синхротрони зазвичай дуже цінні і існують тільки в державних наукових центрах, де вони використовуються кожну хвилину дня і ночі.
У лабораторіях використовуються менші і слабші джерела рентгенівського випромінювання, зазвичай для перевірки якості кристалів перед проведенням досліджень за допомогою синхротрона і для отримання грубого аналізу речовини. У таких системах, електрони вилітають з катода і прискорюються за допомогою електричного потенціалу порядку 50 кВ, після чого бомбардують металеву пластину, що призводить для отримання гальмівного випромінювання і рекомбінантного випромінювання у вигляді декількох сильних спектральних ліній, відповідного порушення електронів внутрішніх орбіталей атома металу. Як матеріал цієї платівки загальне використовуваний мідь, яку легко охолоджувати за її високу теплопровідність, отримуючи яскраві лінії K? and K?. Лінія K? іноді відалаеться допомогою тонгоко шару (0,01 мм) нікелевої фольги. Ці джерела дають близько 2 кВт випромінювання в самому звичайному варіанті і до приблизно 14 кВт в дорогих варіантах.
Отримане рентгенівсь випромінювання зазвичай фільтрується для отримання єдиної довжини хвилі (монохроматичноговипромінювання) хвилі і колімуеться перед подачею на кристал. Фільтрація не тільки спрощує аналіз даних, але і усуває випромінювання, погіршує кристал без додавання корисної інформації. Колімація робиться або за допомогою коллиматор (зазвичай довгою металевої трубки), або певним розташуванням слабо викривлені дзеркал. Дзеркальним системам віддається перевага для маленьких кристалів (до 0,3 мм) або з кристалів з великим розміром кристалічного осередку (більше 150 A).
запис відображень
аналіз даних


симетрії кристала
фазовий аналіз
побудова моделі
Інші методи рентгеноструктурного аналізу
метод Лауе
У методі Лауе вузький (немонохроматичності) пучок рентгенівських променів (або нейтронів) направляється на нерухомо закріплений монокристалічний зразок. Цей пучок включає рентгенівські промені з набором довжин хвиль в широкому інтервалі значень. У кристалі відбувається «відбір», і дифрагує тільки випромінювання з дискретним набором довжин хвиль?, Таких, що для цих довжин хвиль міжплощинних відстані d і кути падіння? задовольняють закону Брегга. Метод Лауе надзвичайно зручний для швидкого визначення симетрії кристала і його орієнтації. Він використовується також для визначення розмірів спотворень і дефектів, що виникають в кристалі при механічній і термічній обробці.
Схема камери Лауе. Джерело рентгенівських променів випускає випромінювання, що має суцільний спектр, з довжинами хвиль, наприклад, від 0,2 A до 2A. Система діафрагм дозволяє отримати добре колімованій пучок. Розміри монокристалічного зразка можуть не перевищувати 1 мм. Плоска рентгенівська плівка розташовується так, що на неї потрапляють або прохідні або відображені дифраговані пучки. Дифракційна картина складається з серії плям (рефлексів), на рис. 2. показана така дифракційна картина для кремнію. Кожна площина кристала, що відображає вибирає з падаючого пучка випромінювання з тією довжиною хвилі, задовольняє закону Брегга 2dsin? = П ?. Отримана дифракційна картина характеризує симетрію кристала: якщо кристал, що має вісь симетрії четвертого порядку, орієнтований так, що ця вісь паралельна падаючому пучку, то лауеграма також матиме вісь симетрії четвертого порядку, Лауеграми широко використовуються для орієнтації кристалів при експериментальному вивченні різних твердих тіл.
Метод Лауе практично ніколи не застосовується для визначення кристалічної структури. Справа в тому, що та ж атомна площину може давати кілька відображень різних порядків, так як для отримання лауеграм використовується широкий інтервал значень довжин волн- тому окремі плями на лауеграмі можуть виявитися результатом накладення відображень різних порядків. Це ускладнює визначення інтенсивності даного відображення, що, в свою чергу, ускладнює визначення базису.
Методи дослідження полікристалів



Методи дослідження аморфних речовин
Дослідження вугільної речовини
Рентгенівська дифрактометрія проводиться під великими, під середніми і під малими (

Увага, тільки СЬОГОДНІ!